معرفة التسلسل النووي(DNA sequencing

)

لا شك أن العلماء يحتاجون إلى معرفة التركيبة التسلسلية لكل جين و هذا يمكنهم من معرفة المزيد عن البروتين الذي يصنعه ذلك الجين وعن التركيبة التنظيمية لعمل الجين و قد يصلون على ضوءه إلى معرفة الأمور التي تتحكم في عمله.كما انه بمعرفة التسلسل النووي للجين يمكن مقارنته بالجينات التي سبق اكتشافها و هذا قد يعطي معلومات غزيرة عن وضيفة هذا الجين و يختصر الكثير من الابحاث

و يتجنب اعادة اجرائها.وهناك طريقتان أساسيتان لمعرفة التسلسل النووي لأي قطعة من الدي إن أي.الأولى تسمى بالطريقة الإنزيمية (Enzymatic method ) و الأخرى بالطريقة الكيميائية(Chemical ).و لقد طغت الطريقة الأولى حتى أصبحت هي الطريقة الأكثر استعمالا.

الطريقة الإنزيمية (Enzymatic method ):
يطلق على هذه الطريقة أيضا طريقة سنجر (Sanger procedure )نسبة إلى د.فريدريك سنجر و الذي أسس هذه الطريقة.كما أنها أيضا تعرف التسلسل عن طريق دي ديوكسي (dideoxy sequencing).و تترتكز هذه الطريقة على مفهوم أن شريط الدي إن أي في الأساس مبنى من جزيئات من الديوكس



يختلف الديوكسي نيوكلويتيد عن دي ديوكسي بيوكلوتيد بعدم و جود مجموعة (هيدروكسي)في النقطة الثالثة من حلقة السكر الخماسية الشكل.

نيوكلويتيد (deoxynucleotides (dNTPs )و يوجد على النقطة الثالثة من حلقة السكر الريبوزي مجموعة مؤكسدة أي مجموعة هيدروكسيه( OH)و هذه النقطة هي التي ترتبط في النقطة الخامسة من الجزيء الذي يليها و هكذا يتم الترابط لتكوّن شريط طويل من الدي إن أي.و لقد قام د.ستنجر بالاستفادة من هذه الخاصية فبدّل الجزيء من (OH)إلى (H ) عن طريق إضافة دي ديوكسيو بيوكلوتيد(ddNTPs) بدل من ديوكسي نيوكلوتيد(dNTPs ) و ذلك عن طريق نسخ الشريط مرة أخرى و هذا يؤدي الى توقف ترابط الجزيئات و يكون في طرف كل جزيء نوع واحد من الأحماض النووية.



و إليك الخطوات الأساسية للقيام بهذا الاختبار بالترتيب:

1- القيام بنسخ الدي ان أي و ذلك على الشكل التالي:

أ- أضف إلى عينة الدي إن أي قطع من البريمر(specific primer)يعرف انه سوف يلتصق بالدي إن أي المراد نسخة و معرّف(ملتصق بطرفة) بعنصر مشع.

ب- قسم العينة إلى أربع أنابيب اختبار و كل أنبوبة اكتب عليها السماء التالية (dGTP, dATP, dCTP, and dTTP)..

ج- أضف إنزيم البولمريز ( DNA polymerase)

د-أضف إلى كل أنبوبة نوع واحد من الدي ديوكسي نيوكليتيد حسب اسم الأنبوب.و أضيف معه كمية من ديوكسي نيولكليتيد.سوف يحدث التفاعل و يبداء البريمر ببنان و تركيب و رص هذه الأحماض النووية.وعند إضافته لدي ديوكسي نيوكليتيد فان الشريط يتوقف على هذه النقطة.ثم يحدث تفاعل أخر لنسخ شريط أخر و عند إضافة دي ديوكسي نيوكليتيد يتوقف التفاعل و هكذا تستمر العملية و ينتج عندي في النهاية قطع منسوخة و متفاوتة الطول في كل أنبوب اختبار.

2- أضيف كمية من كل الأربعة أنابيب في حقل خاص على لوح الاقروز ثم امرر تيار كهربائي و من ثم تظهر على طول اللوح القطع المنسوخة و المتفاوتة الأطوال كل حقل يعطيني ترتيب القطع.

3-تعريضها للأشعة(Autoradiography) لكي يتسنى رؤية الدي إن أي و الذي عليه مادة مشعة.

4- ابدأ بقراءة لوح الاقروز من أسفل إلى أعلى.وكل ما مر على نسخة من الدي إن أي اعرف ترتيب و نوع الديديوكسي نيوكليتيد الذي في طرفة و استمر في القراءة إلى أن ينتهي لوح الاقروز.

و لتسهيل عملية القراءة استخدم الكمبيوتر لكي يقرأها بشكل إلي و ذلك بتعريض لوح الاقروز إلى أشعة ليزر و عن طريق وحدة استشعار و مضخم للنبضات (photomultiplier ) يستطيع الكمبيوتر أن يحدد نوع الدي ديوكسي نيوكليتيد و ثم يرتبها و يطبعها و يعطيك رسماً بيانياً لاماكن كل حمض نووي و بالألوان.و لا تستخدم المواد المشعة في القراءة الآلية بالكمبيوتر بل يستعاض عنها بمادة مضيئة(fluorescent ) توضع على البريمر على أن يكون لكل دي ديوكسي نيوكليتيد لون مختلف عن الآخر(أي أربعة ألوان من المادة المضيئة) و بذلك يمكن أن تمر جميع القطع في ممر واحد كما هو واضح في الرسم الجانبي. و نظرا إلى أن جهاز الكمبيوتر قابل للخطاء فانه يلزم التدقيق و المراجعة لتفادي حدوث الأخطاء.و لقد قامة أجهزة كمبيوتر عملاقة تعمل على مدار الساعة و تحت مظلة مشروع الجينوم البشري بالكشف الكامل(99% تقريباً)من التسلسل النووي لجميع الدي إن أي الموجود في الإنسان و قد سبق ذلك الكشف عن التسلسل النووي لكثير من الكائنات الحية و العمل جاري لمعرفة المزيد.